神奇动物大揭秘：麝（shè）的肠道微生物，你了解吗？
文章题目：Comparison Between theFecal Bacterial Microbiota of Healthy and Diarrheic Captive Musk Deer
合作单位：北京林业大学
杂志名称：Frontiers in Microbiology
影响因子：4.019
研究背景
麝（Noschus noschiferus Linnaeus），又称为麝獐、香獐，种类少，麝的前肢短，后肢长，蹄小耳大，雌雄都无角，雄性有发达獠牙。麝栖居于山林，多在拂晓或黄昏后活动，听觉、嗅觉均发达。雄麝脐香腺囊中的分泌物干燥后形成的香料即为麝香，是一种十分名贵的药材，也是极名贵的香料。麝的数量急剧下降，因为人们为了获得麝香而不断猎杀它们。
我国森林麝的养殖主要分布在两个地区：陕南秦岭山区和四川西部山区。自1958年以来，中国一直在试验森林麝（Moschus berezovskii）养殖，并在过去几十年中在许多方面取得了重大进展。养殖麝的最初目标是减少野生麝鹿资源的压力，以获得有价值的麝香。随着野生麝数量的急剧减少，人工繁殖的麝种群也将构成一种重新引入的重要来源。然而，人工繁殖的森林麝种群长期受到健康不稳定和疾病发病率高等因素的影响。腹泻是人工繁殖的森林麝中最常见的疾病之一。在一些麝养殖场中，严重的腹泻可导致死亡，腹泻的死亡率达到30％。因此，近年来，腹泻已成为人工繁殖麝的疾病预防和控制的重点，虽然相关研究仍然缺乏。
大量研究表明，哺乳动物肠道疾病的发生与肠道微生物的群落结构密切相关。肠道微生物是构成宿主内微生物的主要部分。已经证明肠道微生物群落能够帮助结肠发酵，刺激免疫系统，防御病原体入侵和改善能量获取，对宿主的健康和营养有重要作用。因此，肠道微生物的群落动态是保证寄主生理稳态的重要因素。当正常的微生物群受到外源有害微生物的影响时，其自我平衡将被破坏，这可能导致消化紊乱甚至诱发宿主疾病。本研究通过利用高通量16S-rRNA基因测序技术，全面分析和比较健康和腹泻森林麝粪便微生物群落的组成和结构，旨在为预防和控制麝香鹿的腹泻提供了科学的理论依据，对改善圈养麝鹿的健康状况具有重要意义。
材料与方法
1、试验材料：选择了4-6岁的成年森林麝鹿，包括8只健康麝（HMD）（编号H1-H8），8只轻度腹泻麝（MMD）（编号M1-M8），和5只严重腹泻的麝（SMD）（编号S1-S5）。共收集了21份粪便样本。
2、试验方法：Illumina HiSeq 2500 ，16SV3+V4
结果与分析
1、结果16S-rRNA基因测序结果分析
从8个HMD，8个MMD和5个SMD粪便样品中获得总共1,165,731个高质量序列，并且从每个样品获得48,489-61,048个分析序列（平均长度= 406.3bp）。HMD，MMD和SMD中观察到的物种（OTU）显示在图1A中，每个样品的平均OTU数为675±160。本研究中检测到的数量表明物种的数量随着测序深度的增加而增加。稀释曲线的末端随着每个样品的序列数量的增加而逐渐减少（图1B）。得到的OTU在Silva数据库中进行比对注释，最后得到的细菌主要分为16门，26类，43目，63科和160属。
结果表明，健康麝的肠道微生物具有较高的细菌多样性，而腹泻麝的细菌多样性较低。因此，肠道微生物中细菌物种的丰富性和多样性是“健康”的重要组成部分，它们在维持肠道微生态系统的动态平衡和确保正常生理功能方面有重要作用。
FIGURE 1 | Boxplotand rarefaction curves of operational taxonomic units (OTUs).
2、健康和腹泻的森林麝之间微生物多样性的差异分析
麝鹿粪便样本中Alpha多样性指数（Ace，Chao 1，Simpson和Shannon）（图2）和健康和腹泻的样本β多样性指数统计结果显示：HMD和MMD之间的Ace、Chao 1、Simpson和Shannon指数存在显著差异（P <0.05）。MMD和SMD之间没有显著性差异。HMD和SMD的比较发现有显著性差异（P <0.05）。
FIGURE 2 | Boxplot ofAlpha-diversity indices. Alpha diversity indexes are composite indexesreflecting abundance and consistency.
β多样性用于分析物种组成的时间和空间变化，反映群体间细菌群落是否存在差异。NMDS图显示了微生物群落的不同，并揭示了腹泻和健康麝鹿之间的独特结构（图3）。
FIGURE 3 | Non-metricmultidimensional scaling (NMDS) analysis.
组间和组内β距离在箱型图中显示（图4），结果表明HMD和MMD组（图4A）之间以及HMD和SMD组之间细菌群落的极显著差异（图4B）（ P <0.01）。
FIGURE 4 | Box plot ofInter-group and Intra-group Beta distance (ANOSIM Analysis).
3、核心微生物组成及相对丰度
物种分类柱状图是表示HMD、MMD和SMD样本中物种的组成及对应物种在该样本中的相对丰度。HMD、MMD和SMD样本中在门水平和属水平相对丰度前10的物种如图5所示。无论是否存在腹泻的样本中，厚壁菌和拟杆菌都是主要的优势菌。然而，健康森林麝的粪便中厚壁菌的相对丰度明显高于腹泻麝。厚壁菌是构成食物中纤维素分解代谢并将纤维素降解为宿主挥发性脂肪酸的主要细菌类型。此外，厚壁菌门还可以调节体内免疫反应，抑制病原体的侵袭和预防肠道炎症。腹泻麝肠道中厚壁细胞丰度的减少可能会同时降低该物种的消化生理功能。另外，β多样性的比较显示，健康和腹泻森林麝的细菌群落差异极显著，这与麝的异常消化生理功能有关。HMD、MMD和SMD三组不同样本之间共有OTU和特有OTU数量如图6所示。
FIGURE 5 | Histogram of relativeabundance. The x-axis represents groups and the y-axis represents relativeabundance presented as percentage.
FIGURE 6 | Venn diagram.
4、健康与腹泻森林麝的显著差异分析及功能基因预测
LefSe分析表明（图7），在属的水平上，MMD组与HMD和SMD组之间显著性差异较大的菌种为埃希氏菌 - 志贺氏菌。埃希氏菌属 - 志贺氏菌是常见的病原体，其主要的传播途径包括：受感染对象的粪便、食物和含有细菌的水。该病原体可引起结肠粘膜炎症，导致腹痛、腹泻和形成粘膜粪便等症状。因此，用于喂养麝的食物和水以及粪便管理是减轻轻度腹泻的关键。另外，SMD组与HMD和MMD组之间显著性差异较大的菌种为梭杆菌。梭杆菌是炎症性微生物，它可抑制体内T细胞应答并促进炎性因子的表达。比较MMD组和SMD组，可以推测Fusobacterium可能在轻度腹泻的背景下增殖并成为主要病原体。因此，森林麝的肠道生理紊乱与其主要病原体的类型是存在一定的相关性的。
FIGURE 7 | LefSe analysis.
使用PICRUSt软件通过比对16S测序数据获得的物种组成信息，推测样本中的功能基因组成，从而分析不同样本或分组之间在功能上的差异（图8）。与HMD相比组，免疫疾病代谢途径中功能基因的丰度在腹泻森林麝中显著增加。肠道微生物的存在可以刺激宿主免疫系统的发育，增强宿主免疫功能，禁止病原微生物入侵。而肠道微生物引起的腹泻可以影响宿主的免疫能力，从而增加对免疫疾病的易感性。此外，它还可能对宿主中生物系统的细胞免疫过程和代谢途径产生影响。更加深入的研究还需以宏基因组分析来确认基因功能信息的准确性。
FIGURE 8 | (A) The abundance ratio ofdifferent functions between HMD and MMD. (B) The abundance ratio of differentfunctions between HMD and SMD.
结论
肠道微生物的群落结构与组成较为复杂，腹泻森林麝鹿粪便中微生物种类较健康麝多，由许多潜在的原因导致的。除了我们此项研究的细菌病原体外，还可能是由于病毒、肠易激综合征（IBS）等因素导致。因此该项目更深一步的研究还要根据宏基因组测序手段来进行研究。
本研究通过利用高通量16S-rRNA基因测序技术，全面分析和比较健康和腹泻森林麝粪便微生物群落的组成和结构，旨在为预防和控制麝香鹿的腹泻提供了科学的理论依据，对改善圈养麝鹿的健康状况具有重要意义。
参考文献：YimengL , Xiaolong H , Shuang Y , et al. Comparison Between the Fecal BacterialMicrobiota of Healthy and Diarrheic Captive Musk Deer[J]. Frontiers inMicrobiology, 2018, 9:300-.